новини

Протягом останнього десятиліття технологія секвенування генів широко використовується в дослідженнях раку та клінічній практиці, ставши важливим інструментом для виявлення молекулярних характеристик раку. Досягнення в молекулярній діагностиці та таргетній терапії сприяли розвитку концепцій прецизійної терапії пухлин та внесли значні зміни в усю галузь діагностики та лікування пухлин. Генетичне тестування може бути використане для попередження ризику раку, прийняття рішень щодо лікування та оцінки прогнозу, а також є важливим інструментом для покращення клінічних результатів пацієнтів. Тут ми підсумовуємо нещодавні статті, опубліковані в CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol та інших журналах, щоб розглянути застосування генетичного тестування в діагностиці та лікуванні раку.

Соматичні мутації та мутації зародкової лінії. Загалом, рак спричинений мутаціями ДНК, які можуть бути успадковані від батьків (мутації зародкової лінії) або набуті з віком (соматичні мутації). Мутації зародкової лінії присутні від народження, і мутатор зазвичай несе мутацію в ДНК кожної клітини організму та може передаватися потомству. Соматичні мутації набуваються індивідами в негаметичних клітинах і зазвичай не передаються потомству. Як зародкові, так і соматичні мутації можуть руйнувати нормальну функціональну активність клітин і призводити до злоякісної трансформації клітин. Соматичні мутації є ключовим фактором злоякісності та найбільш прогностичним біомаркером в онкології; однак приблизно від 10 до 20 відсотків пацієнтів з пухлинами несуть мутації зародкової лінії, які значно підвищують ризик раку, і деякі з цих мутацій також є терапевтичними.
Мутація-водій та мутація-пасажир. Не всі варіанти ДНК впливають на функцію клітин; в середньому для запуску нормальної дегенерації клітин потрібно від п'яти до десяти геномних подій, відомих як «мутації-водії». Мутації-водії часто виникають у генах, тісно пов'язаних з життєвою активністю клітин, таких як гени, що беруть участь у регуляції росту клітин, репарації ДНК, контролі клітинного циклу та інших життєвих процесах, і мають потенціал для використання як терапевтичні мішені. Однак загальна кількість мутацій у будь-якому раку досить велика, коливаючись від кількох тисяч у деяких видах раку молочної залози до понад 100 000 у деяких високоваріабельних колоректальних та ендометріальних видах раку. Більшість мутацій не мають або мають обмежене біологічне значення, навіть якщо мутація відбувається в кодуючій області, такі незначні мутаційні події називаються «мутаціями-пасажирами». Якщо варіант гена в певному типі пухлини передбачає його відповідь на лікування або стійкість до нього, варіант вважається клінічно операбельним.
Онкогени та гени-супресори пухлин. Гени, які часто мутують при раку, можна умовно розділити на дві категорії: онкогени та гени-супресори пухлин. У нормальних клітинах білок, кодований онкогенами, головним чином відіграє роль у сприянні проліферації клітин та пригніченні апоптозу клітин, тоді як білок, кодований генами-онкосупресорами, головним чином відповідає за негативну регуляцію поділу клітин для підтримки нормальної функції клітин. У процесі злоякісної трансформації геномна мутація призводить до посилення активності онкогенів та зниження або втрати активності генів-онкосупресорів.
Малі варіації та структурні варіації. Це два основні типи мутацій у геномі. Малі варіанти змінюють ДНК, змінюючи, видаляючи або додаючи невелику кількість основ, включаючи вставку основ, делецію, зсув рамки зчитування, втрату старт-кодона, втрату стоп-кодона тощо. Структурні варіації – це великі перебудови геному, що включають сегменти генів розміром від кількох тисяч основ до більшої частини хромосоми, включаючи зміни кількості копій генів, делецію хромосом, дуплікацію, інверсію або транслокацію. Ці мутації можуть спричинити зниження або посилення функції білка. Окрім змін на рівні окремих генів, геномні сигнатури також є частиною звітів про клінічне секвенування. Геномні сигнатури можна розглядати як складні патерни малих та/або структурних варіацій, включаючи пухлинне мутаційне навантаження (TMB), мікросателітну нестабільність (MSI) та дефекти гомологічної рекомбінації.

Клональні мутації та субклональні мутації. Клональні мутації присутні у всіх пухлинних клітинах, присутні під час постановки діагнозу та залишаються присутніми після завершення лікування. Таким чином, клональні мутації мають потенціал для використання як терапевтичні мішені для лікування пухлин. Субклональні мутації присутні лише у підмножині ракових клітин і можуть бути виявлені на початку діагностики, але зникають з подальшим рецидивом або з'являються лише після лікування. Гетерогенність раку стосується наявності кількох субклональних мутацій в одному раку. Примітно, що переважна більшість клінічно значущих драйверних мутацій у всіх поширених видах раку є клональними мутаціями та залишаються стабільними протягом усього прогресування раку. Резистентність, яка часто опосередковується субклонами, може не виявлятися під час постановки діагнозу, але з'являється, коли рецидивує після лікування.

Традиційний метод FISH або каріотипування клітин використовується для виявлення змін на хромосомному рівні. FISH можна використовувати для виявлення злиттів, делецій та ампліфікацій генів і вважається «золотим стандартом» для виявлення таких варіантів, з високою точністю та чутливістю, але обмеженою пропускною здатністю. При деяких гематологічних злоякісних новоутвореннях, особливо при гострому лейкозі, каріотипування все ще використовується для діагностики та прогнозування, але цей метод поступово замінюється цільовими молекулярними аналізами, такими як FISH, WGS та NGS.
Зміни в окремих генах можна виявити за допомогою ПЛР, як у реальному часі, так і в цифровій краплинній ПЛР. Ці методи мають високу чутливість, особливо підходять для виявлення та моніторингу невеликих залишкових уражень і дозволяють отримувати результати за відносно короткий час, недоліком є ​​обмежений діапазон виявлення (зазвичай виявляють мутації лише в одному або кількох генах), а також обмежена можливість проведення кількох тестів.
Імуногістохімія (ІГХ) – це інструмент моніторингу на основі білків, який зазвичай використовується для виявлення експресії біомаркерів, таких як ERBB2 (HER2) та рецептори естрогену. ІГХ також може бути використана для виявлення специфічних мутованих білків (таких як BRAF V600E) та специфічних злиттів генів (таких як злиття ALK). Перевагою ІГХ є те, що її можна легко інтегрувати в процес рутинного аналізу тканин, тому її можна поєднувати з іншими тестами. Крім того, ІГХ може надати інформацію про субклітинну локалізацію білків. Недоліками є обмежена масштабованість та високі організаційні вимоги.
Секвенування другого покоління (NGS) NGS використовує високопродуктивні методи паралельного секвенування для виявлення варіацій на рівні ДНК та/або РНК. Цей метод може бути використаний для секвенування як усього геному (WGS), так і досліджуваних ділянок генів. WGS надає найповнішу інформацію про геномні мутації, але існує багато перешкод для його клінічного застосування, включаючи необхідність свіжих зразків пухлинної тканини (WGS ще не підходить для аналізу зразків, іммобілізованих формаліном) та високу вартість.
Цільове секвенування NGS включає секвенування всього екзону та панель цільових генів. Ці тести збагачують області інтересу за допомогою ДНК-зондів або ПЛР-ампліфікації, тим самим обмежуючи обсяг необхідного секвенування (весь екзом становить від 1 до 2 відсотків геному, і навіть великі панелі, що містять 500 генів, складають лише 0,1 відсотка геному). Хоча секвенування всього екзону добре працює у фіксованих формаліном тканинах, його вартість залишається високою. Комбінації цільових генів є відносно економічними та забезпечують гнучкість у виборі генів для тестування. Крім того, циркулююча вільна ДНК (cfDNA) з'являється як новий варіант геномного аналізу онкологічних пацієнтів, відомий як рідка біопсія. Як ракові клітини, так і нормальні клітини можуть вивільняти ДНК у кровотік, а ДНК, що виділяється з ракових клітин, називається циркулюючою пухлинною ДНК (ctDNA), яку можна проаналізувати для виявлення потенційних мутацій у пухлинних клітинах.
Вибір тесту залежить від конкретної клінічної проблеми, яку потрібно вирішити. Більшість біомаркерів, пов'язаних із затвердженими методами лікування, можна виявити за допомогою методів FISH, IHC та ПЛР. Ці методи є доцільними для виявлення невеликої кількості біомаркерів, але вони не покращують ефективність виявлення зі збільшенням пропускної здатності, і якщо виявлено занадто багато біомаркерів, тканини для виявлення може бути недостатньо. У деяких специфічних випадках раку, таких як рак легенів, де зразки тканин важко отримати, і є кілька біомаркерів для тестування, використання NGS є кращим вибором. На завершення, вибір аналізу залежить від кількості біомаркерів, які потрібно протестувати для кожного пацієнта, та кількості пацієнтів, яких потрібно протестувати на біомаркер. У деяких випадках достатньо використання IHC/FISH, особливо коли мішень визначена, наприклад, виявлення рецепторів естрогену, рецепторів прогестерону та ERBB2 у пацієнтів з раком молочної залози. Якщо потрібне більш комплексне дослідження геномних мутацій та пошук потенційних терапевтичних мішеней, NGS є більш організованим та економічно ефективним. Крім того, NGS може бути розглянуто у випадках, коли результати IHC/FISH є неоднозначними або непереконливими.

Різні рекомендації дають вказівки щодо того, які пацієнти повинні мати право на генетичне тестування. У 2020 році Робоча група ESMO Precision Medicine опублікувала перші рекомендації щодо NGS-тестування для пацієнтів з запущеним раком, рекомендуючи рутинне NGS-тестування для зразків пухлин запущеного неплоскоклітинного недрібноклітинного раку легенів, раку передміхурової залози, колоректального раку, раку жовчних проток та раку яєчників, а у 2024 році ESMO оновила цю рекомендацію на цій основі, рекомендуючи включити рак молочної залози та рідкісні пухлини, такі як шлунково-кишкові стромальні пухлини, саркоми, рак щитовидної залози та рак невідомого походження.
У 2022 році в Клінічній висновку ASCO щодо тестування соматичного геному у пацієнтів з метастатичним або запущеним раком зазначено, що якщо терапія, пов'язана з біомаркерами, схвалена для пацієнтів з метастатичними або запущеними солідними пухлинами, для цих пацієнтів рекомендується генетичне тестування. Наприклад, геномне тестування слід проводити пацієнтам з метастатичною меланомою для скринінгу мутацій BRAF V600E, оскільки інгібітори RAF та MEK схвалені для цього показання. Крім того, генетичне тестування також слід проводити, якщо є чіткий маркер резистентності до препарату, який буде призначено пацієнту. Наприклад, Egfrmab неефективний при колоректальному раку з мутацією KRAS. При розгляді придатності пацієнта для секвенування генів слід інтегрувати фізичний стан пацієнта, супутні захворювання та стадію пухлини, оскільки низка кроків, необхідних для секвенування геному, включаючи згоду пацієнта, лабораторну обробку та аналіз результатів секвенування, вимагає від пацієнта достатньої фізичної працездатності та тривалості життя.
Окрім соматичних мутацій, деякі види раку також слід тестувати на наявність генів зародкової лінії. Тестування на мутації зародкової лінії може вплинути на рішення щодо лікування таких видів раку, як мутації BRCA1 та BRCA2 при раку молочної залози, яєчників, передміхурової залози та підшлункової залози. Мутації зародкової лінії також можуть мати значення для майбутнього скринінгу та профілактики раку у пацієнтів. Пацієнти, які потенційно підходять для тестування на мутації зародкової лінії, повинні відповідати певним умовам, які включають такі фактори, як сімейний анамнез раку, вік на момент постановки діагнозу та тип раку. Однак багато пацієнтів (до 50%), які несуть патогенні мутації в зародковій лінії, не відповідають традиційним критеріям тестування на мутації зародкової лінії на основі сімейного анамнезу. Тому, щоб максимізувати виявлення носіїв мутацій, Національна комплексна мережа раку (NCCN) рекомендує, щоб усі або більшість пацієнтів з раком молочної залози, яєчників, ендометрію, підшлункової залози, колоректального раку або передміхурової залози проходили тестування на мутації зародкової лінії.
Що стосується термінів генетичного тестування, оскільки переважна більшість клінічно значущих драйверних мутацій є клональними та відносно стабільними протягом прогресування раку, доцільно проводити генетичне тестування у пацієнтів під час діагностики запущеного раку. Для подальшого генетичного тестування, особливо після молекулярно-таргетної терапії, тестування цтДНК є більш вигідним, ніж ДНК пухлинної тканини, оскільки ДНК крові може містити ДНК з усіх пухлинних уражень, що сприяє отриманню інформації про гетерогенність пухлини.
Аналіз ctDNA після лікування може передбачити відповідь пухлини на лікування та виявити прогресування захворювання раніше, ніж за допомогою стандартних методів візуалізації. Однак протоколи використання цих даних для прийняття рішень щодо лікування не були встановлені, і аналіз ctDNA не рекомендується, окрім випадків клінічних випробувань. ctDNA також може бути використана для оцінки невеликих залишкових уражень після радикальної операції з видалення пухлини. Тестування ctDNA після операції є сильним предиктором подальшого прогресування захворювання та може допомогти визначити, чи отримає пацієнт користь від ад'ювантної хіміотерапії, але все ще не рекомендується використовувати ctDNA поза клінічними випробуваннями для прийняття рішень щодо ад'ювантної хіміотерапії.

Обробка даних Першим кроком у секвенуванні геному є виділення ДНК зі зразків пацієнтів, підготовка бібліотек та генерування необроблених даних секвенування. Необроблені дані потребують подальшої обробки, включаючи фільтрацію даних низької якості, порівняння їх з референсним геномом, ідентифікацію різних типів мутацій за допомогою різних аналітичних алгоритмів, визначення впливу цих мутацій на трансляцію білків та фільтрацію мутацій зародкової лінії.
Анотація гена-водія розроблена для розрізнення мутацій гена-водія та гена-пасажира. Мутації-водії призводять до втрати або посилення активності гена-супресора пухлини. Невеликі варіанти, що призводять до інактивації генів-супресорів пухлини, включають нонсенс-мутації, мутації зі зсувом рамки зчитування та мутації ключового сайту сплайсингу, а також менш часті делеції стартового кодону, делеції стоп-кодону та широкий спектр мутацій вставки/делеції інтронів. Крім того, міссенс-мутації та невеликі мутації вставки/делеції інтронів також можуть призвести до втрати активності гена-супресора пухлини, впливаючи на важливі функціональні домени. Структурні варіанти, що призводять до втрати активності гена-супресора пухлини, включають часткову або повну делецію гена та інші геномні варіанти, що призводять до руйнування рамки зчитування гена. Невеликі варіанти, що призводять до посиленої функції онкогенів, включають міссенс-мутації та епізодичні вставки/делеції інтронів, що спрямовані на важливі функціональні домени білка. У рідкісних випадках укорочення білка або мутації сайту сплайсингу можуть призвести до активації онкогенів. Структурні варіації, що призводять до активації онкогенів, включають злиття генів, делецію генів та дуплікацію генів.
Клінічна інтерпретація геномної варіації оцінює клінічне значення виявлених мутацій, тобто їх потенційну діагностичну, прогностичну або терапевтичну цінність. Існує кілька систем класифікації, заснованих на доказах, які можна використовувати для керівництва клінічною інтерпретацією геномної варіації.
База даних онкологічної онкології Меморіального онкологічного центру Слоуна-Кеттерінга (OncoKB) класифікує варіанти генів на чотири рівні на основі їх прогностичної цінності для застосування ліків: рівень 1/2, схвалені FDA або клінічно стандартні біомаркери, які прогнозують відповідь на схвалений препарат за певним показанням; рівень 3, схвалені FDA або несхвалені біомаркери, які прогнозують відповідь на нові таргетні препарати, що продемонстрували багатообіцяючі результати в клінічних випробуваннях, та рівень 4, несхвалені FDA біомаркери, які прогнозують відповідь на нові таргетні препарати, що продемонстрували переконливі біологічні докази в клінічних випробуваннях. Було додано п'яту підгрупу, пов'язану з резистентністю до лікування.
У рекомендаціях Американського товариства молекулярної патології (AMP)/Американського товариства клінічної онкології (ASCO)/Коледжу американських патологоанатомів (CAP) щодо інтерпретації соматичних варіацій соматичні варіації поділяються на чотири категорії: I ступінь – з вираженим клінічним значенням; II ступінь – з потенційним клінічним значенням; III ступінь – клінічне значення невідоме; IV ступінь – клінічне значення невідоме. Тільки варіанти I та II ступеня є цінними для прийняття рішень щодо лікування.
Шкала клінічної операбельності молекулярних мішеней (ESCAT) ESMO класифікує варіанти генів на шість рівнів: рівень I – мішені, придатні для рутинного використання; фаза II – мішень, яка все ще вивчається, ймовірно, буде використовуватися для скринінгу популяції пацієнтів, які могли б отримати користь від цільового препарату, але для її підтвердження потрібні додаткові дані. ступінь III – цільові варіанти генів, які продемонстрували клінічну користь при лікуванні інших видів раку; ступінь IV – лише цільові варіанти генів, підтверджені доклінічними доказами; ступінь V – є докази, що підтверджують клінічну значущість таргетної терапії мутації, але терапія одним препаратом проти мішені не подовжує виживання, або може бути прийнята комбінована стратегія лікування; ступінь X – відсутність клінічної цінності.